DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Egenskaper, grund, användning

han DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Det är ett färgämne som genom sin fluorescerande egenskap fungerar som en markör, som är allmänt att användas i fluorescens- eller flödescytometri -mikroskopitekniken, bland andra. Den fluorescens som den släpper ut är ljusblå, dess spänning sker mellan 455-461 nm (UV-ljus).

DAPI -färgämnet kan korsa cellmembranet från döda celler med mycket lätthet. Du kan också färga levande cellkärnor, men i detta fall måste koncentrationen av detta vara större.

Kemisk struktur av fluorescerande dyst. Källa: Bild: Fil: DAPI.SVG är en vektorversion av den här filen. Det bör användas i stället för denna rasterbild när inte lägre/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // Creativecommons.Org/licenser/BY-SA/3.0/)] Redigerad bild

Färgens kan komma åt det cell -DNA genom vilket det har en speciell affinitet och sammanfogar stor aviditet till adenin- och tyminkvävebaserna. Av denna anledning är det mycket användbart i vissa tekniker för molekylärbiologi.

Denna förening tillhör gruppen av indoliska färgämnen och har visat sig ha större känslighet för DNA än etidiumbromid och propidious jodid, särskilt om agarosgeler.

Användningen av detta fluorescerande färgämne är mycket bred, eftersom det är användbart för: att studera förändringar i DNA i apoptotiska processer (celldöd) och därför upptäcka celler i denna process; för DNA -fotavtrycksfoto (fotografisk tryckning av DNA); att studera bakteriell förorening; o För att visualisera kärnkraftssegmentering.

Det har också använts i studien av kromosomala band, vid detekteringen av DNA från Mycoplasmas sp, I DNA-proteininteraktion, vid färgning och räkning av celler genom immunofluorescens och till och med färgning av mogna pollenkorn.

[TOC]

Egenskaper

DAPI är förkortningen av dess kemiska namn (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Dess molekylformel är c₁₆H_femtonN_5. Den har en molekylvikt på 350.3. Nära UV-ljusområdet (345 till 358 nm) inträffar den maximala excitationen av DAPI-ADN-komplexet, medan den maximala fluorescensemissionen inträffar mellan 455-461 nm.

Detta färgämne kännetecknas av att vara ett gult damm, men strukturerna markerade med denna fluorofor avger ett ljusblått ljus.

Det är dock en vattenlöslig förening för att påskynda dess upplösning kan viss värme appliceras. Det kan spädas ut med PBS men inte upplöses direkt i detta.

Det kan tjäna dig: Arsenioso Acid (H3SO3): Egenskaper, risker och användningar

När färgämnet har förberetts måste det förvaras i mörker, det vill säga skyddat från ljus, vid en temperatur av 2 till 8 ° C (kylskåp). Under dessa förhållanden är färgämnet stabilt i mer än 3 veckor eller månader.

Om ljuset är skyddat men stabiliteten lämnas vid rumstemperatur till 2 eller 3 veckor, men utsätts för direkt ljus är försämringen mycket snabb. Om du vill spara mycket längre kan du kyla vid -20 ° C distribuerad i alikvoter.

Grund

Denna färg är baserad på att generera en nukleär anställning i huvudteknikerna för molekylärbiologi, såsom: flödescytometri, fluorescensmikroskopi och färgning av metafasiska kromosomer eller gränssnittskärnor, bland andra.

Denna teknik är baserad på den stora affiniteten som färgämnet har för kvävebaser (adenin och timin) som finns i det genetiska materialet (DNA) i mindre spår. Medan på cytoplasmisk nivå lämnar väldigt lite botten.

När föreningen av fluorescerande färgämne till regionerna med adenin och timina av DNA inträffar ökar fluorescens avsevärt (20 gånger mer). Färgen som den släpper ut är ljusblå. Det bör noteras att det inte finns någon emission av fluorescens vid bindning till GC-baspar (guanina-citosin).

Det är viktigt att lyfta fram att även om det också har en affinitet för RNA, orsakar det inte ett problem, eftersom den större graden av energiutsläpp av denna molekyl uppstår till en annan våglängd (500 nm), till skillnad från DNA som gör det till 460 nm. Dessutom är ökningen av fluorescens en gång kopplad till RNA endast 20%.

DAPI används mer för att dyra döda (fasta) celler som du lever, eftersom det är nödvändigt att en mycket högre koncentration av färgämnet behövs, eftersom det beror på att cellmembranet är mycket mindre permeabel för att det lever när det lever när det lever när det lever.

DAPI -färgämne kan användas i kombination med röda och gröna fluoroforer för att få en mångfärgad upplevelse.

Använda sig av

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) är en utmärkt fluorofor och används därför allmänt i olika tekniker och för olika ändamål. Användningen av DAPI förklaras nedan i huvudteknikerna.

Flödescytometri

Forskarna Gohde, Schumann och Zante 1978 var de första som använde och föreslog DAPI som en fluorofor i flödescytometri -tekniken, med stor framgång på grund av deras höga känslighet med DNA och dess höga intensitet i utsläppet av fluorescens.

Det kan tjäna dig: en aminogrupp (NH2): Struktur, egenskaper, exempel

Användningen av DAPI i denna teknik gör det möjligt att studera cellcykeln, kvantifiering av celler och färgning av levande och döda celler.

Även om det finns andra färgämnen, såsom etidiumbromid, Hoechst -oxid, akridinorange och propidiojodid, är DAPI en av de mest använda för att vara mer bilder än de som nämns ovan.

För denna teknik är det nödvändigt. Provet centrifugeras och supernatanten är kasserad.

Medan tiden passerar DAPI -färgämnet med en färgningsbuffert (Foxp3 från Biolegend) till en 3 um.

Centrifugera provet, kasta supernatanten och täck sedan med 1 ml DAPI -lösning i 15 minuter vid rumstemperatur.

Ta provet till flödescytometern med höger laser.

Flödesmikrofluorometri

En annan teknik där DAPI används finns i mikro-fluorometri av flöde tillsammans med en annan fluorofor som heter Mitramical. Båda är användbara för kvantifiering.

Hybridisering In situ 

Denna teknik använder i princip DNA -prober märkt med ett fluorescerande färgämne som kan vara DAPI.

Provet kräver att de behandlas med värme för att denaturalisera det två klassen DNA och förvandla det till två monocypenära kedjor. Därefter hybridiseras den med en DNA -sond märkt med DAPI som har en sekvens av intresse.

Därefter tvättas det för att eliminera det som inte var hibrid, en kontrast används för att visualisera DNA. Fluorescensmikroskopet tillåter observation av den hybridiserade sonden.

Denna teknik är avsedd att detektera specifika sekvenser i kromosomalt DNA, att kunna diagnostisera vissa sjukdomar.

Dessa citomolekylära tekniker har varit till hjälp för att bestämma detaljer i studien av karyotyperna. Till exempel har det visat regionerna rika par av adenosin- och tyminbaser som kallas heterokromatiska regioner eller DAPI -band.

Kan tjäna dig: permeabilitet: koncept, enheter, faktorer, exempel

Denna teknik används allmänt för att studera kromosomer och kromatin i växter och djur, liksom för diagnos av prenatala och hematologiska patologier hos människan.

I denna teknik är den rekommenderade DAPI -koncentrationen 150 ng/ml under en tid på 15 minuter.

De redan monterade objektglasen bör skyddas från ljus vid 2-8 ° C.

Färgning av immunofluorescens

Cellerna är fixerade med 4% paraformaldehyd. Om andra färgämnen kommer att användas, lämnas DAPI i slutet som anställning och cellerna med PBS -lösning i 15 minuter täcks. Medan tiden går, förbered DAPI -lösningen utspädning med PBS, så att den slutliga koncentrationen är 300 um.

Sedan extraheras överskottet av PBS och täcks med DAPI i 5 minuter. Tvätta flera gånger. Arket observeras i ett fluorescensmikroskop under rätt filter.

Säkerhetsark

Denna förening måste manipuleras noggrant, eftersom det är en förening som har mutagena egenskaper. Aktivt kol används för att eliminera denna förening av vattenhaltiga lösningar som kommer att kasseras.

Handskar, mantel och säkerhetslinser bör användas för att undvika olyckor med detta reagens. Om kontakt eller slemkontakt inträffar, bör du tvätta området med tillräckligt med vatten.

Du ska aldrig rör om detta reagens med munnen, använda propipeter.

Förorenar inte reagenset med mikrobiella medel, eftersom detta kommer att resultera i felaktiga resultat.

Utspäd inte DAPI -färgämnesen mer än rekommenderas, eftersom färgkvaliteten kommer att minska avsevärt avsevärt.

Exponera inte reagenset för direkt ljus, eller håll värmen eftersom det minskar fluorescensen.

Referenser

1. Brammer S, Toniazzo C och Poersch L. Vanligtvis entreprenade cholars na vegetabiliska cytogenetik. Arq. Instans. Biogus. 2015, 82. Tillgänglig från: Scielo.
2. Laboratorier. Dapi. Finns på: Menarinidiagnostics.com/
3. Cytocelllaboratorier. 2019. Instruktioner för användning av DAPI. Finns på Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Begrepp och tekniker i flodekologin. (2009). Redaktionella rubes, Spanien. Finns på: böcker.Google.co.gå/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Användning av fluorescens i en modifierad dissektormetod för att uppskatta antalet myocyter i hjärtvävnaden. Arq. Behåar. Kardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tillgänglig från: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Närvaro av fytoplasmas i papayo (Carica papaya) i Mexiko. Chapingo Magazine. Trädgårdserie, 2011; 17 (1), 47-50. Finns på: Scielo.org.