Bradford Method Vad är, princip, reagens, använder

han Bradford Method Det är en kolorimetrisk metod som för närvarande används för snabb uppskattning av total proteinkoncentration i biologiska experimentprover. Det används inom många områden inom biologisk, medicinsk, veterinär, agronomisk forskning etc.

Det är känt som "Bradford Method" eftersom det först beskrevs av Marion Bradford 1976, i sin publikation med titeln En snabb och känslig metod för kvantifiering av proteiner i mängder av mikrogram med principen om protein-Youth Union.

Fotografi av en ELISA-plack där prover har förberett sig för en Bradford-kvantifiering (källa: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Sedan dess förslag har denna metod populärt populärt, eftersom den är erkänd mer känslig än andra proteinkvantifieringsmetoder (till exempel Lowry och Biuret, till exempel); mer stabil komplex form och är ekonomisk och lätt att genomföra.

Dessutom har det visats att reagensen de använder har mycket liten störning i spektrofotometriska mätningar under olika förhållanden.

[TOC]

Metodprincip

Bradfords metod är baserad på kvantifiering av färgförändringar i en lösning på grund av unionen - under sura förhållanden - av proteinmolekylerna i ett prov med molekylerna i ett speciellt färgämne: Coomassie Blue Lysande blå G250.

När detta färgämne tillsätts till en proteinlösning binder den till dessa molekyler genom elektrostatiska krafter och denna reaktion bevisas som en rödbrun färgförändring till blått till blått.

Proteiner och aminosyror

Precis som kroppen bildas av många celler och nukleinsyror (såsom DNA och RNA) bildas av nukleotider, bildas proteiner av ordnade sekvenser av vissa molekyler som kallas aminosyror.

En aminosyra är en molekyl som består av en central kolatom till vilken fyra olika kemiska grupper förenas: en väteatom, en karboxylgrupp, en aminogrupp och en grupp eller sidokedja, som ger identiteten.

Det finns 20 aminosyror som är vanliga för alla proteiner, som skiljer sig från varandra med avseende på egenskaperna hos deras sidogrupper: det finns grundläggande aminosyror, syror, polära, apolära, cykliska, aromatiska, etc.

Kan tjäna dig: Shelfords toleranslag: Vad är och exempel

Summan av egenskaperna hos dessa aminosyror och den ordning de går med för att bilda proteinstrukturen ger varje protein en serie speciella fysikalisk -kemiska egenskaper, oavsett om de beträffar deras belastning, deras massa, deras hydrofobicitet, bland andra.

Färgproteinkomplex

Bradfords metod kvantifierar då närvaron av aminosyrarester av grundläggande egenskaper i biologiska prover, särskilt aminosyror såsom arginin, lysin och histidin, som är de som lättare är tillmötesgående med coomassieblått.

Färgförändringar kvantifieras som variationer i absorbansen av proverna, som mäts med användning av en spektrofotometer justerad till en våglängd av 595 nm.

Vad är absorbans?

Det är också känt som optisk densitet och definierar mängden ljus som absorberas av en lösning. Denna absorption beror på våglängden för ljuset som används för att bestråla lösningen, eftersom inte alla molekyler kan absorbera samma våglängd.

Detta fenomen sammanfattades i en lag som kallas Beer-Lamberts lag, som fastställer förhållandet mellan minskningen av mängden ljus som passerar genom ett ämne och egenskaperna hos nämnda substans.

Till exempel, när ett ljus överförs genom en lösning, finns det två intensitetsåtgärder: en incidentintensitet (innan man passerar lösningen) och en överförd intensitet (i allmänhet lägre, vilket motsvarar fraktionen av ljus som inte absorberades av lösningen).

Förhållandet mellan båda värdena är det som kallas bearbetning och har värden mellan 0 och 1 eller uttrycks i procentuella termer.

Absorbans är relaterad till bearbetning av logaritmiskt sätt, och öl-Lamberts lag föreslår ett linjärt samband mellan absorbansen av en lösning och dess koncentration, dess molära utrotningskoefficient och lösningens optiska koefficient; Den matematiska ekvationen som beskriver denna lag är som följer:

Kan tjäna dig: skadlig fauna: orsaker till spridning, konsekvenser, kontroll

A (absorbans) = ε (molär utrotningskoefficient) c (koncentration) l (lätt passlängd)

Koncentrationen av en lösning beräknas genom att rensa nämnda okända för ekvationen och utföra de relevanta beräkningarna (C = A/εL)

Vad är en spektrofotometer?

Det är en anordning som används för att kvantifiera mängden ljus (beroende på våglängden) som absorberar molekylerna i en lösning eller med andra ord mängden ljus de passerar.

Spektrofotometrar fungerar genom att avge en ljusstråle (synlig eller ultraviolett) som passerar genom ett prisma (eller en enhet känd som diffraktionsnätverksmonokromator) Det bryter ner det i de olika våglängderna som utgör det, vilket gör att "väljer" en viss längd.

Detta ljus passeras genom ett speciellt rör som innehåller provet som analyseras och därefter når en detektor som uppfattar mängden ljus som överförs från nämnda prov (som inte absorberades) som kan observeras senare tack vare en "tolk" som har ett grafiskt gränssnitt.

Färgens: Coomassie Blue Lysande blå G 250

Det viktigaste reagenset med denna metod är utan tvekan färgämnet som används för att "markera" proteinerna i provet. Bradford föreslog sitt jobb eftersom detta färgämne finns på två sätt: en röd och en blå. Den röda formen blir den blå formen när färgämnet binder till ett protein och bildar ett komplex.

Blue-proteinblå komplexet har en mycket hög molär utrotningskoefficient, vilket resulterar i större känslighet för kvantifiering av proteinkoncentrationen i de analyserade proverna.

Reagens

Även om lösningen som används för denna kvantifieringsmetod i allmänhet marknadsförs i stängda containrar, redan förberedda -"Bradford -reaktiva" -, är de viktigaste reagensen som används:

- Coomassie Blue Lysande blå G50 (0.01% w/v)

- Fosforsyra (8.5 % vikt/volym)

- Etanol (4.7% vikt/volym)

Proteinkvantifieringssats med Bradfords metod (källa: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Liksom i alla metoder och proteinkvantifieringsprotokoll med spektrofotometriska metoder är det nödvändigt att ha ett "standard" eller "standard" -protein för att utföra en kalibreringskurva för att bestämma absorbansvärdena relaterade till olika koncentrationer av protein; Generellt används bovint serumalbumin.

Kan tjäna dig: Chocolate Agar

Metoden består i att blanda vissa volymer av proverna problem med vissa volymer av Bradfords reagens; Vänta ett par minuter på färgämne-proteininteraktion och färgförändring är uppenbar och mäts därefter och registrera absorbansvärdena för att utföra efterföljande beräkningar.

Användning/applikationer

Bradfords metod är en av kvantifierings- eller uppskattningsmetoderna för den mest använda proteinkoncentrationen i världen, främst på grund av dess låga kostnad, till den hastighet som resultaten erhålls, till den stora stabiliteten mellan proteinet och färgämnet som används, för att dess reproducerbarhet och den minsta störning som komponenterna i reagensen som användes under mätningen har.

Metoden används i hundratals olika vetenskapliga tillämpningar för bestämning av proteiner i olika sammanhang: fysiologiska, cytologiska, immunologiska, kliniska, industriella (särskilt inom livsmedelsindustrin) etc.

Experimentellt är denna metod mycket användbar för:

• Övervaka mängden protein som finns i de volymer som gradvis erhålls från en kromatografisk kolonn (i affinitetskolonner, jonbyte, absorption, gelfiltrering, bland andra) i.och. Analysera fraktioner av proteinreningsprotokoll.
• Övervaka mängden protein som laddas i en gel för elektrofores.
• Uppskatta mängden protein som erhållits i ett överuttryckssystem.

Referenser

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, s. R. (2001). Proteininnehållskvantifiering med Bradford -metoden. I Handbook of Plant Ecophysiology Techniques (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). En snabb och känslig metod för kvantifiering av mikrogrammängder protein med hjälp av huvudproteindagens bindning. Analytisk biokemi, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, i. L. (2020). Bradford -analys för att bestämma proteinkoncentration. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-PROT102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Pris, n. C. (1999). Kolorimetriska proteinanalysstekniker. Bioteknik och tillämpad biokemi, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (nitton nittiosex). Protein Protocols Handbook (Vol. nitton nittiosex). Springer Science & Business Media.