Proteinas K -egenskaper, enzymatisk aktivitet, applikationer

De Proteina K Det är ett enzym som tillhör gruppen serinproteaser, det vill säga det har i sitt aktiva katalytiska centrum en serinaminosyra och har funktionen att bryta peptidbindningarna genom hydrolys. I sin tur tillhör detta enzym familjen av subtilisinproteiner (peptidas S8).

K -proteinaset har en molekylvikt (PM) på 28.900 Daltons och isolerades först i 1.974 i svampextrakt Engyodontium album, tidigare känd som namnet på Tritirachium album Limber.

Molekylstruktur av K -proteinaset. Källa: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenser/BY-SA/4.0)]

Det presenterar en hög proteolytisk kapacitet, demonstrerad genom att kunna förnedra keratinet närvarande i håret. Ordet keratin på engelska är skriven "keratin", därifrån kommer det att det har kallats "Proteinsa K".

På grund av sin höga kraft för att dela nativa proteiner är detta enzym användbart i olika tekniker för molekylärbiologi. Huvudsakligen används för att isolera och framställa nukleinsyror med hög molekylvikt (PM).

K -proteinas verkar genom att frigöra kärn -DNA, samtidigt som proteiner förstör och inaktivt för RNaser och DNATE, det vill säga eliminerar nukleas i DNA- och RNA -beredningar.

Å andra sidan har man sett att K -proteinas kan hydrolysera vissa denaturerade nativa proteiner, vilket har gjort forskarnas intresse för användning i studien av prionproteiner (PRPC).

Trots dess höga proteolytiska kraft finns det emellertid proteiner som är resistenta mot verkan av K -protein. Bland dem finns det några anomala proteiner som kallas prioner (PRPSC), associerade med överförbara spongiforma encefalopatier.

[TOC]

Egenskaper för proteinaset K

K -proteinaset har en tertiär struktur som består av tre lager, med ett ß -ark med sju medicinska kedjor mellan två lager propeller. För att tillhöra familjen av peptidaser kännetecknas S8 av att presentera en katalytisk triad på sin aktiva plats, vars sekventiella ordning är (ASP, hans och varelse), som skiljer dem från andra peptidasfamiljer.

Det kan tjäna dig: proteinaminosyror

Detta enzym från serinproteasgruppen kännetecknas av hydrolyserande peptidbindningar nära den karboxylgruppen av alifatiska och aromatiska aminosyror.

Å andra sidan kan den verka i närvaro av vissa frätande ämnen, såsom natriumdodecilsulfate (SDS), Tris-HCl och EDTA, som används för att hjälpa denaturering av proteiner, vilket får dem att förlora sin ursprungliga struktur.

Detta är ett tidigare steg i framställningen av proteiner för elektroforesstekniken. PH -intervallet till vilket K -proteinsa verkar är ganska bredt (2.0 till 12.0), med ett optimalt pH mellan 7.5 till 12.0, och dess isoelektriska punkt är 8.9. Som framgår är den aktiv mot ett mycket brett spektrum av pH.

En annan funktion som sticker ut i K -proteinaset är dess stabilitet i närvaro av höga temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

K -proteinsa behöver närvaron av kalciumjon, även om den inte påverkar dess aktivitet, om det är viktigt att bibehålla sin stabilitet.

För att K -proteinsa ska utföra den fullständiga matsmältningen av underlaget är en ungefärlig kontakttid nödvändig mellan 5 minuter upp till 2 timmar.

I denna mening jämförde emellertid Daza och kollaboratörer renheten hos DNA som erhölls vid flera exponeringstider mot K -proteinaset och drog slutsatsen att en långvarig inkubation (upp till 24 timmar) avsevärt förbättrar DNA: s kvalitet.

Nu, i förhållande till koncentrationen som används av K -proteinasenzymet i de olika protokollen, kan det sägas att det är mycket varierat.

Det kan användas från mycket låga koncentrationer (5 | ig/ml) till 500 ug/ml koncentrationer. Men de vanligaste arbetskoncentrationerna varierar mellan 50-100 μg /ml, särskilt för proteinsatsmältning och nukleas. Även för vävnadsbehandling krävs en koncentration av 2 mg/ml.

Kan tjäna dig: Easmotherium Sibiricum: Egenskaper, livsmiljöer, fossiler

Ansökningar

Deras applikationer är mycket breda och kan sammanfattas i följande:

-Det används i protein-matsmältning och DNA-extraktion med flera metoder såsom: saltning, PK-SDS, cetyl-tritetylammonium (CTAB), modifierad kaliumacetat och natriumjodid-extraktionsacetat.

-Inaktivering av nukleasas (RNASAS och DNASAS).

-I hybridiseringstekniken In situ (Hans), för att hjälpa frisläppandet av nukleinsyra, förutom att eliminera oönskade proteiner.

-Proteinmodifiering.

-På forskningsnivå, i olika studier.

Fördelar med K -proteinas

Olika jämförande studier har genomförts mellan DNA -extraktionstekniker som använder K -proteinas, med andra som inte använder det och alla drar slutsatsen att det finns större fördelar när enzymet används. Bland fördelarna kan följande nämnas:

-DNA med hög molekylär, hög kvalitet och renhet erhålls.

-Det extraherade DNA är stabilt i upp till 3 månader.

DNA -extraherat kan användas i följande tekniker: Southern blot, polymeraskedjereaktion (PCR), elektrofores, bland andra.

Proteinasresistenta K -proteiner

Olika undersökningar har kommit fram till att prioner (toxiska PrPSC -anomala proteiner skiljer sig från PRPC (nativa) proteiner genom att vara resistenta mot verkan av K -proteinas, medan PRPC är känsliga för deras verkan.

Andra författare har beskrivit att i strukturen för PRPSC finns det känsliga delar och andra resistenta mot K -proteinaset. Båda parter är dock lika giftiga och smittsamma.

Å andra sidan isolerade Bastian och kollaboratörer 1987 4 proteiner från 28, 30, 66 och 76 kDa från en slags slags Spiroplasma mirum. Alla visade sig vara resistenta mot K -proteinasets verkan och hade också en korsreaktion med vissa prioner.

Kan tjäna dig: kemotoxis

Det är känt att denna art kan orsaka viktiga grå starr och neurologiska skador och på grund av de vetenskapliga resultaten från Bastian, bland annat forskning, har den försökt relatera till denna mikroorganism med överförbar spongiform encefalopatier överförbara.

Emellertid förblir etiologin för denna degenerativa neurologiska patologi för närvarande till prioner.

I detta avseende identifierade Butler och kollaboratörer 1991 en klass av ett 40 kDa KDA -proteinas -resistent från två stammar från två stammar av Mycoplasma hyorhinis. Denna patogen påverkar grisar och infekterar sina vävnader, men i detta fall fanns det ingen korsreaktion med de testade fängelserna.

Mer forskning krävs för att belysa många okända i detta avseende.

Referenser

1. Bastian F, Jennings R och Gardner W. 1987. Antiserum till skrapieasocierat fibrilprotein korsreaktioner med Spiroplasma mirum Fibrilproteiner. J. Klinka. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Utvärdering av en DNA -extraktions- och reningsmetod från muskelvävnad fixerad i formaldehyden av oidentifierade lik.  Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E och McGarrity G. Identifiering och karakterisering av protein K-resistenta proteiner i medlemmar i klassmollicutes.  Infektion och immunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marocoima A, Herrera L, et al. Jämförelse av två DNA -extraktionsprotokoll av Trypanosoma cruzi odlad i axheniskt medium. Varv. Peru. Med. Exp. Folkhälsan  2014; 31 (2): 222-227. Finns på: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E och Palma W. Bestämning av effektiviteten hos fem DNA -extraktionsprotokoll från paraffinerat material för molekylstudier. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.