Immunofluorescens Foundation, Protocol and Applications

De immunofluorescens Det är en kraftfull immunomarcy -teknik som använder antikroppar United kovalent till fluorescerande molekyler för att identifiera specifika mål i cellprover fixerade på ett fast stöd.

Denna teknik mikroskopisk observation med immunspecificitet, vilket möjliggör observation av levande eller döda celler som kan ha små mängder antigener. Det används allmänt både inom forskningsområdet och i den kliniska diagnosen av olika patologier.

Immunomarin av aktinfilament i kardiomyocytceller (källa: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenser/BY-SA/4.0)] via Wikimedia Commons)

Denna främst kvalitativa teknik (med vissa kvantitativa varianter) måste göra specifikt med visualisering av ett prov av produkten från en fluorofor, som är en fluorescerande molekyl fäst vid en antikropp och som kan spännande sig vid en viss våglängd.

I cellsammanhanget är det mycket användbart att studera närvaro/frånvaro och subcellulär plats för proteiner. Tekniken användes i början inom det kliniska området för diagnos av virus som influensa och därefter för många andra infektionssjukdomar.

Det är en teknik med stor känslighet, och med rätt mikroskopi -team kan det ha en mycket bra upplösning. Det kräver för sin observation användning av konfokala eller epifluorescensmikroskop.

Trots att du är mycket populär kan du emellertid presentera några viktiga problem när det gäller att få ospecifik fluorescens som genererar ett visst "brus" i bakgrunden, vilket ofta begränsar korrekt läsning av resultaten.

[TOC]

Grund

Immunofluorescens är baserad på exploatering av det biologiska fenomenet av interaktionsreaktionen mellan en antikropp och ett antigen. Det måste göra specifikt med visualisering eller upptäckt av denna reaktion när spännande fluorescerande molekyler vid en specifik våglängd.

En antikropp är ett immunglobulinprotein utsöndrat från aktiva B -celler och genereras specifikt mot ett antigen, som kan förenas med stor affinitet och specificitet. Immunofluorescens använder sig av IgG -immunoglobuliner, som finns lösligt i blodserum.

Antikropparna är molekyler upp till 950 kDa sammansatta av två korta peptid (ljus) och två längder i form av "Y" (tung). Både lätta och tunga kedjor är uppdelade i två domäner: en variabel, som kan känna igen antigenet och en annan konstant eller bevarad, karakteristisk för varje art.

Antigener definieras funktionellt som molekyler som kan kännas igen av en antikropp och är mestadels proteiner. När ett djur utsätts för ett antigen aktiveras immunsystemlymfocyter, vilket ger specifika antikroppar mot det och fungerar som ett försvarssystem.

Ett antigen, såsom ett protein, till exempel, kan ha mer än en epitop eller plats för erkännande för en antikropp, så serumet hos djuret som utsätts för ett antigen kan ha polyklonala antikroppar mot olika regioner av samma protein.

Det kan tjäna dig: Epidermis of the Onion

Immunofluorescens utnyttjar då förmågan hos ett djur att producera polyklonala antikroppar mot ett specifikt antigen för att rena det och senare använda det för att upptäcka samma antigen i andra sammanhang.

Among the most used fluorescent dyes or molecules for some immunofluorescence techniques are fluorescein isootiocyanate (FITC), tetramethylrodamine-5 and 6 (tritc) isochianate, many cyanines such as Cy2, Cy3, Cy5 and Cy7 and dyes called Alexa Fluor® , like the Alexa Fluor®448.

Protokoll

Immunofluorescensprotokollet varierar beroende på många faktorer, men i allmänhet omfattar en linjär sekvens av steg som består av:

• Beredning av ark och celler
• Provfixering
• Permeabilisering
• Blockering
• Immunotive eller immunomarcaje
• Montering och observation

-Förberedelse

Av proverna

Beredningen av proverna beror på deras natur och vilken typ av erfarenhet som ska genomföras. Därefter kommer det enklaste fallet att förklaras, vilket innebär användning av suspenderade celler.

Suspensionsceller, det vill säga i ett flytande odlingsmedium, måste först separeras från detta genom centrifugering och sedan bör tvättas med en buffertlösning eller "buffert" isosmotisk, som bevarar dess integritet.

Normalt används en fosfat-saltbuffert känd som PBS, där cellerna resuspen.

Av lakan

Ark som används för mikroskopisk observation, där cellerna kommer att ställas in för motsvarande nedströmsbehandlingar, måste också vara noggrant beredda.

Dessa är täckta eller "sensibiliserade" med en polysinlösning, en syntetisk polymer som kommer att tjäna som "molekyllim" mellan celler och fast stöd, tack vare den elektrostatiska interaktionen mellan de positiva laddningarna för deras aminogrupper och de negativa belastningarna av proteiner som täcker celler.

Provfixering

Denna process består i att immobilisera proteinerna som finns i den cellulära inre för att hålla sin rumsliga plats intakt. De använda molekylerna bör kunna korsa alla typer av cellmembran och bilda ramar med kovalenta proteiner.

Formaldehyden och paraformaldehyd, glutaraldehyd och till och med metanol används allmänt, med vilka cellprover inkuberas under en viss tid och sedan tvättar dem med en isosmotisk buffertlösning.

Efter fixeringen av cellerna fortsätter den att gå med dem till de tidigare sensibiliserade arken med polysin.

Permeabilisering

Beroende på vilken typ av test som utförs kommer det att vara nödvändigt att permeabilisera eller inte cellerna som studeras. Om det som söks är att veta platsen, närvaron eller frånvaron, av ett visst protein på cellytan, kommer permeabilisering inte att vara nödvändig.

Kan tjäna dig: fosfatidylinositol: struktur, träning, funktioner

Å andra sidan, om du vill veta platsen för ett protein inuti den cellulära inre, är permeabilisering oumbärlig och kommer att bestå av att inkubera prover med Triton X-100, ett tvättmedel som kan permeabilisera cellmembran.

Blockering

Ett grundläggande steg i alla immunologiska tekniker är att blockera. I detta skede av proceduren består blockaden av att täcka, i de sensibiliserade ark, alla platser med polyesinmolekyler till vilka celler inte följdes. Det vill säga det förhindrar någon ospecifik union.

Normalt för att blockera lösningar med albumin av vassle bovint (BSA) används i PBS -buffert och de bästa resultaten erhålls ju längre det är inkubationstiden med denna lösning. Efter varje steg, inklusive blockaden, är det nödvändigt att ta bort den återstående lösningen genom att tvätta.

Immunotive eller immunomarcaje

Immunomarin eller immunomarinessförfarandet beror främst om det är en direkt eller indirekt immunofluorescens (se senare).

Om det är en primär eller direkt immunofluorescens kommer proverna att inkuberas med de önskade antikropparna, som måste kopplas till fluorescerande färgämnen. Inkubationsproceduren består av att göra en utspädning av antikroppen i en lösning som BSA också kommer att innehålla men i en lägre andel.

När fallet är för en sekundär eller indirekt immunofluorescens måste två på varandra följande inkubationer göras. Först med de önskade antikropparna och sedan med antikropparna som kan upptäcka de ständiga regionerna för primära immunglobuliner. Det är dessa sekundära antikroppar som är förenade kovalent mot fluoroforer.

Tekniken är mycket mångsidig, vilket möjliggör samtidiga märken med mer än ett antigen per prov, så länge de har primära antikroppar kopplade till olika fluoroforer, i fallet med direkt immunfluorescens.

För samtidiga märken i indirekt immunofluorescens är det nödvändigt.

Liksom blockaden ger inkubation med antikroppar bättre resultat desto större tid för detta. Efter varje steg är det nödvändigt att tvätta överskottet av antikroppar som inte gick med i proverna och i den sekundära immunfluorescensen är det nödvändigt att blockera innan den sekundär antikroppen tillsätter den sekundära antikroppen.

Vissa tekniker använder andra färgämnen som inte har något att göra med immunomarin, såsom kärn -DNA -färgning med DAPI -fluorofor.

Montering och observation

Under den slutliga inkubationstiden med fluoroforer är det nödvändigt att proverna förblir i mörkret. För observation av mikroskop är det vanligt.

Grabbar

Grafisk sammanfattning av direkt och indirekt immunofluorescens (källa: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenser/BY-SA/4.0)] via Wikimedia Commons)

Direkt eller primär immunofluorescens

Det har att göra med detektering av antigener genom användning av fluorescerande antikroppar. Den största fördelen med användningen av denna teknik är dess hastighet, men många fall av ospecifik förening kan inträffa i processen, särskilt när man studerar mänskliga sera, eftersom de är rika på mycket heterogena antikroppar.

Kan tjäna dig: de 5 grenarna i huvudbiotekniken

Indirekt eller sekundär immunfluorescens

Det är också känt som "smörgåsen" -tekniken och detta innebär utvecklingen av tekniken i två steg. Den första har att göra med användning av en icke -fluorescerande antikropp och dess förening till antigen av intresse.

Mot det ständiga området för denna första antikropp (som nu kommer att tjäna som ett antigen) är en andra antikropp som kan erkänna den, som är associerad med en fluorescerande molekyl.

Utseendet på en fluorescerande signal kommer att vara resultatet av det specifika erkännandet mellan den första icke -fluorescerande antikroppen och intressanten; Närvaron av de första antikroppsförhållandena som den andra, som är märkt och tack vare vilken närvaron eller frånvaron av antigenet kan bestämmas.

Trots att den är en teknik som konsumerar mycket längre än direkt immunofluorescens (eftersom den inkluderar ett mer inkubationssteg) innebär denna teknik inte utformningen av en fluorescerande antikropp för varje antigen som studeras, vilket i ekonomiska termer är mer livskraftiga.

Dessutom är det en mer känslig teknik när det gäller signalförstärkning, eftersom mer än en sekundär antikropp kan gå med i det ständiga området för den primära antikroppen och därmed förstärka intensiteten hos den fluorescerande signalen.

Ansökningar

Som tidigare märkts är immunofluorescens en extremt mångsidig teknik, till vilken mångfald av användningsområden inom de vetenskapliga och kliniska områdena har givits. Det kan användas för att svara på ekologiska, genetiska och fysiologiska frågor angående många organismer.

Bland kliniska tillämpningar används det för direkt diagnos av vissa dermatologiska sjukdomar, oavsett om du använder direkt eller indirekt immunofluorescens på epitelvävnad hos de studerade patienterna.

Immunofluorescenstekniker har arrangerats i encellulära organismer såsom jäst för att visualisera intranukleära och cytoplasmiska mikrotubuli, aktin och tillhörande proteiner, 10nm filament och andra beståndsdelar av cytoplasma, membran och cellväggar.

Referenser

1. Abcam, immunocytokemi och immunofluorescensprotokoll. Hämtad från Abcam.com
2. GREPH, C. (2012). Fluorescerande färgämnen. Hämtad från Leica-mikrosystem.com
3. Miller, D. M., & Shakest, D. C. (nittonhundranittiofem). Immunofluorescensmikroskopi. I Metoder i cellbiologi (Vol. 48, sid. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, jag. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescenstekniker. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Prins, f. J. R., Adams, a. OCH. M., Druain, D. G., & Brian, K. (1991). Immunofluorescensmetoder för yeas. I Enzymologi (Vol. 194, sid. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, e. V, & widelock, d. (1964). Tillämpningar av immunoflorens i folkhälsovirologi. Bakteriologiska recensioner, 28(4), 402-408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (nitton nittiosex). Immunofluorescens i fytoplanktonforskning: Applications and Potential. J: Phycol., 32, 1-16.