Half Löwenstein-Jensen Foundation, förberedelse och användning

han Mitten löwenstein-jensen Det är ett selektivt fast medium för isolering och utveckling av bakterier i släktet Mycobacterium, till exempel Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, bland annat, med undantag för spannmålen, som inte kan odlas.

Bakterier av släktet Mycobacterium växer inte i konventionella kulturmedier, därför var det nödvändigt att utforma ett speciellt sätt för dess isolering. Det ursprungliga mediet skapades av Löwenstein och modifierades sedan av Jensen.

Half Löwenstein-Jensen med kolonier av Mycobacterium tuberculosis. Källa: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Med tillstånd av Biology Image Library

Modifieringen bestod av eliminering av Kongo Red Dye och ersatte det för större koncentration av malakitgrön. Det förändrade också koncentrationerna av magnesiumcitrat och monopotasisk fosfat.

Löwenstein-Lose-mediet innehåller för närvarande en papatstärkelse, asparragin, magnetisk citrat, monopo-fasfosfat, magnetisk sulfat, malakitgrön, nalidíico-syra, cykloheximid.

Mycobacteria är normalt isolerat från platser som inte är sterila, såsom sputum, urin, abscesser, bland andra. Detta innebär att de flesta prover kommer att innehålla den vanliga mikrobiota i området, plus patogenen.

Det är därför Löwenstein-Jensen-mediet innehåller en serie hämmare i sin sammansättning representerad av malakitgrön, antibiotika och svampdödande medel.

Dessutom måste prover som kommer från icke-steril plats dekontamineras och neutraliseras innan de sås i Löwenstein-Jensen Medium.

[TOC]

Grund

Närvaron av ägg och glycerin i Löwenstein-Jensen Medium stimulerar tillväxten av mykobakterier eftersom de tillhandahåller fettsyror och proteiner som är nödvändiga för att utveckla dessa mikroorganismer.

Löwenstein-Jensen-mediet innehåller malakitgrön, som är en bifogad mikrobiotainhibitor. Men den innehåller också nalidíxisk syra (35 ug/ml), vilket hämmar den gram -negativa mikrobiota, cykloheximid (400 ug/ml), vilket hämmar saproféer svampar och jästar och lynch (2 μ/ml), vilket hämmar mikrobiota gram positivt positivt positivt.

Vissa kommersiella hus föredrar att lägga till följande kombination av antibiotika: Polymixina B 200.000 enheter/L, amfotericin B 10 mg/L, karbenicillin 50 mg/L och trimetoprima 10 mg/L.

Detta medium innehåller inte agar, därför uppstår stelningen av mediet genom koagulering av albuminet som finns i ägget under sterilisering.

Förberedelse

Väg 37,3 g av det dehydratiserade mediet i 600 ml destillerat vatten som tidigare har tillsatts 12 ml glycerol. Blandningen värms upp och rör ofta tills dess totala upplösning. Autoclavar mediet vid 121 ° C i 15 minuter.

Kan tjäna dig: De 12 stadierna av mänsklig utveckling och dess egenskaper

Å andra sidan bör en homogen suspension av 1000 ml färska ägg framställas under aseptiska förhållanden. Tillsätt äggsuspensionen vid 600 ml beredd vid en temperatur av 50 - 60 ° C, och undvik luftbubblor.

Antibiotikalösningar tillsätts också efter sterilisering i autoklav.

Häll mediet i sterila provrör med en gängplugg. Värm rören vid 85 ° C i 45 minuter i lutande läge.

Färgen på det beredda mediet är aguamaringrönt och kan presentera vitaktiga punkter för närvaro av ägglipider.

Medium pH måste vara 7,2 ± 0,2

Spara kylrören och skyddas från direkt ljus till användning. Sjunka före sådd.

Det finns en modifiering av mediet som kallas "Gruft -modifiering av Löwenstein Jensen". Detta innehåller samma föreningar som det klassiska mediet men RNA-5 mg/100 ml tillsätts, och som hämmare innehåller den malakitgrön 0,025 g/100 ml, penicillin 50 u/ml och nalidíico 35 ug/ml syra.

Ansökningar

Löwenstein-Jensen-mediet används för mykobakteriasolering, från olika typer av prover. Det rekommenderas att utföra en Ziehl-Neelsen-färgning till alla prov där närvaron av mykobakterier misstänks.

Vissa prover kommer från sterila platser men andra gör det inte. Icke -sterila prover måste dekontamineras i närheten av fallet kan vara:

Sputum

Sputumprover måste dekontamineras enligt följande: Bestäm mängden sputumprov i ML och tillsätt samma mängd av 4% NaOH och incube till 37 ° C.

Skaka blandningen ofta under en period av 30 minuter. Därefter centrifugue vid 3000 rpm i 30 minuter.

Kassera supernatanten på en fenoldesinfektionslösning. Använd sådd sediment, men först måste pH neutraliseras.

För att neutralisera sedimentet används H₂Sw₄ vid 5% i närvaro av den röda fenolindikatorn tills den leder till ett neutralt pH som har sitt ursprung i en laxfärg.

Gastrisk tvätt, bronkial tvätt och bronkial aspirat

I detta fall bör provet vara centrifug vid 3000 rpm i 30 minuter. Supernatanten kasseras och sedimentet används. För att dekontaminera sedimentet tillsätts 3 ml av 4% NaOH och omrörs ofta vid 37 ° C under en halvtimme.

Kan tjäna dig: stroma (histologi)

Centrifug igen, supernatanten kasseras och sedimentet används. Det senare måste neutraliseras som förklaras i sputumprovet.

Urin

Låt provet i kylen i 24 timmar. Separera supernatanten. Det återstående sedimentet måste centrifugeras i 30 minuter vid 3000 RMP. Kassera supernatanten igen och rekonstituera sedimentet med 3 ml steril fysiologisk lösning.

Tillsätt 3 ml 4% NaOH och fortsätt till dekontaminering och neutralisering som beskrivits tidigare.

Ascitisk vätska, pleurvätska, cerebrospinalvätska

I denna typ av prov centrifugeras den och supernatanten kasseras. Gör ett gram till sedimentet eller observera direkt i mikroskopet; Om bakterier inte observeras är passagen av dekontaminering inte nödvändig och varken neutraliseringen.

I detta fall kan provet sådd direkt med sedimentet. Om det finns bakterier, fortsätt att dekontaminera och neutralisera som beskrivits ovan.

Biopsier

Denna typ av prov ska tillsättas 5 ml destillerat vatten till senare centrifug vid 1500 rpm under 10 minuter. Kassera supernatanten och centrifugera sedimentet vid 3500 rpm i 30 minuter. Använd sedimentet för att så odlingsmediet.

Hiophare laryngeal

Vickan måste införas i ett sterilt rör som innehåller lika delar av destillerat vatten och 4% NaOH. Vattpinnen måste pressas på rörets väggar så att provet utspäddes i vätskan. Centrifug och använd sediment. Neutralisera sedimentet som redan beskrivits.

Såtas

Löwenstein-Jensen media ympas genom att tillsätta 0,5 ml av provet på ytan av mediet. Rotera röret för att distribuera provet i hela mediet. Bär inte platinahandtag.

Du kan så ett andra rör som innehåller halv stenbrink för att isolera Mycobacterium bovis och andra arter som inte växer i Löwenstein-Jensen-miljön.

Inkubation

Inokulerade rör inkuberas vid aerobios vid 37 ° C, med ett något lat lock och lutar vid ungefär 5 ° och skyddas från ljus. Miljön med koldioxid kan berikas till 5-10%. Kontrollera grödor två gånger i veckan tills koloniernas utseende.

Det kan tjäna dig: Nasal Exsudate: Vad är det för, procedur, odling

När provet har absorberats justeras taporna. Den maximala inkubationstiden är 8 veckor, om det efter denna tid inte har någon tillväxt rapporteras som negativ.

QA

Som kvalitetskontroll kan du använda följande stammar:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium Kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

För de första tre nämnda arterna förväntas en utmärkt utveckling, att M. Fortitiit Tillväxten måste vara bra, medan för M. Bo knapp eller nolltillväxt förväntas. Medan andra arter än släktet Mycobacterium måste hämmas helt.

Begränsningar

Det beredda mediet måste skydda sig mot ljus, långvarig exponering för ljus gör att mediet varv från grönt till blått, i detta fall kan mediet inte längre användas. Detta beror på att Malachites gröna är footositive.

Mediet, som det innehåller ägg, kan lätt förorenas om det inte manipuleras aseptiskt. Det kan lösas om det är förorenat med proteolytiska bakterier.

Odling och manipulation av bakterier i släktet Mycobacterium kräver kvalificerad personal, som är medveten om de biosäkerhetsåtgärder som måste uppfyllas för att undvika att vara förorenade eller förorenande andra.

HCL bör inte användas vid passagen av neutralisering på grund av bildningen av natriumklorid, vilket kan vara giftigt för Koch Bacillus.

Prover måste hållas kylda och skyddade från ljus så länge de inte bearbetas.

Referens

1. Laboratorier Francisco Soria Melguizo. 2009. Löwenstein-Jensen Selective Medium. Finns på: f-soria.är
2. Britania Laboratories. 2017. Löwenstein-jensen medium. Finns på: Britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-jensen medium. Finns på: FoodSafety.Neogen.com.
4. "Mitt i Löwenstein-Jensen." Wikipedia, fri encyklopedi. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24 april 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan. Pan -amerikanska redaktionella.TILL. Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 ed. Pan -amerikanska redaktionella.TILL. Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokemiska tester för identifiering av klinisk betydelse bakterier. 3: e upplagan. Pan -amerikansk redaktion. Buenos Aires. Argentina.